中国疾控中心 2002 年病毒学考博真题（样本展示）

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中国疾控中心 2002 年病毒学考博真题（精选样本）

一、名词解释（每题 5 分，精选 2 题）

1. Anti-sense oligodeoxynucleotide
2. Reverse genetics

二、简答题（每题 10 分，精选 1 题）

1. 决定动物病毒感染时细胞嗜性的主要因素有哪些，为什么？

三、论述题（每题 20 分，精选 1 题）

答案详解（附考点定位、核心要点）

一、名词解释答案

1. Anti-sense oligodeoxynucleotide（反义寡脱氧核苷酸）

• 考点定位：本题聚焦病毒学分子生物学核心技术术语，是 “病毒基因调控与干预” 章节的基础考点，考查对核酸类抗病毒工具的定义与核心功能的精准理解。
• 答案详解：
  反义寡脱氧核苷酸是一类人工合成的、长度通常为 15-25 个核苷酸的单链 DNA 分子，其序列与靶标病毒 mRNA（或基因组 RNA）的特定区域互补。
  核心功能是通过碱基互补配对结合靶标 RNA，进而抑制病毒基因的表达：一是阻止 mRNA 与核糖体结合，阻断翻译过程；二是激活细胞内 RNA 酶 H，降解结合后的双链 RNA 复合物；三是可干扰病毒 RNA 的剪接或转运，最终抑制病毒复制。
  该技术具有特异性高、作用靶点明确的特点，是抗病毒药物研发与病毒基因功能研究的重要工具。

2. Reverse genetics（反向遗传学）

• 考点定位：本题聚焦病毒学核心研究方法，是 “病毒基因组学与分子生物学” 章节的核心考点，考查对该技术定义、原理及应用的系统阐释。
• 答案详解：
  反向遗传学是相对于传统正向遗传学（从表型推基因）而言的分子生物学研究方法，核心是通过定向修饰病毒基因组（如基因缺失、插入、突变），再将修饰后的基因组转入宿主细胞，观察病毒的复制、表型及致病性变化，从而反向推导该基因的功能。
  核心原理是依赖病毒基因组的体外构建与复活技术 —— 通过 PCR 扩增、基因克隆等手段改造病毒基因组 cDNA，再利用转录体系获得有感染性的病毒 RNA（或直接转入 DNA 病毒基因组），使其在宿主细胞内复制产生子代病毒。
  主要应用包括：解析病毒基因功能、研发减毒活疫苗（通过缺失毒力基因）、构建病毒载体、研究病毒致病性机制等，是现代病毒学研究的核心技术之一。

二、简答题答案

1. 决定动物病毒感染时细胞嗜性的主要因素有哪些，为什么？

• 考点定位：本题聚焦病毒感染的核心机制，是 “病毒感染与致病机制” 章节的核心难点考点，考查对病毒与宿主细胞相互作用关键环节的系统梳理。
• 答案详解：
  动物病毒的细胞嗜性（即病毒对特定组织或细胞类型的感染偏好）由病毒与宿主细胞双方的多种因素共同决定，核心因素及原因如下：

1. 病毒表面吸附蛋白与宿主细胞受体的特异性结合

   这是决定细胞嗜性的首要因素。病毒表面的包膜糖蛋白（如流感病毒血凝素 HA）或衣壳蛋白（如脊髓灰质炎病毒 VP1）需与宿主细胞表面的特异性受体（如糖蛋白、糖脂、细胞因子受体）结合，才能启动感染过程。

   例如，HIV 的 gp120 蛋白仅识别宿主细胞表面的 CD4 分子与 CCR5/CXCR4 辅助受体，因此仅感染 CD4+ T 淋巴细胞、巨噬细胞等细胞；乙肝病毒需结合肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体，故主要感染肝细胞。受体的组织分布特异性直接决定病毒的嗜性范围。
2. 宿主细胞内的复制辅助因子（许可因子）

   病毒结合受体进入细胞后，其复制依赖宿主细胞提供的多种辅助因子（如酶类、转录因子、转运蛋白等），若细胞缺乏该类因子，即使病毒成功进入也无法完成复制。

   例如，丙肝病毒的复制需要肝细胞内的 miR-122（一种微小 RNA），该 miRNA 仅在肝细胞中高表达，因此丙肝病毒具有严格的肝细胞嗜性；腺病毒的复制需要宿主细胞的 E1A 结合蛋白，不同细胞中该蛋白的表达水平差异影响病毒复制效率。
3. 宿主细胞的抗病毒防御机制

   宿主细胞的天然免疫防御能力（如干扰素应答、RNA 干扰、限制性内切酶系统）存在组织和细胞类型差异，也会影响病毒的嗜性。

   例如，某些细胞（如巨噬细胞）天然具有强大的抗病毒活性，可快速清除入侵病毒，因此不易被感染；而靶细胞（如呼吸道上皮细胞）的抗病毒防御较弱，更易成为病毒的感染对象。
4. 病毒的包膜融合或衣壳脱壳机制

   病毒进入细胞后，需通过包膜与细胞膜融合（包膜病毒）或衣壳脱壳（无包膜病毒）释放基因组，这一过程可能依赖细胞特定的细胞器或信号通路。

   例如，流感病毒的包膜融合需要内体酸化环境触发 HA 蛋白构象变化，若细胞内体酸化机制异常，病毒无法脱壳，也就无法完成感染，这也在一定程度上限制了病毒的嗜性。

三、论述题答案

1. 已知某一病毒外膜蛋白的序列，如何从病毒的基因组中将该蛋白的基因克隆，并对其表达产物进行鉴定？

• 考点定位：本题聚焦病毒学核心实验技术，是 “病毒基因克隆与蛋白表达鉴定” 章节的核心综合考点，考查对基因克隆、表达及鉴定全流程的实验设计与技术细节的掌握。
• 答案详解：
  整个流程分为 “基因克隆”“蛋白表达”“表达产物鉴定” 三大核心步骤，具体操作如下：

（1）病毒外膜蛋白基因的克隆

1. 病毒基因组提取：根据病毒类型（DNA 病毒 / RNA 病毒）选择提取方法 ——DNA 病毒可直接用酚 - 氯仿法提取基因组 DNA；RNA 病毒需先通过 RT-PCR 将 RNA 逆转录为 cDNA，再以 cDNA 为模板进行后续操作。
2. 特异性引物设计：根据已知的外膜蛋白氨基酸序列，利用生物信息学工具（如 ExPASy、Primer Premier 5）反向推导其编码基因序列（需考虑密码子偏好性），设计一对特异性引物，引物两端需引入合适的酶切位点（如 EcoRⅠ、XhoⅠ），便于后续克隆到表达载体。
3. 目的基因扩增：以病毒基因组 DNA（或 cDNA）为模板，进行 PCR 扩增 —— 反应体系包括模板、引物、Taq 酶、dNTPs、缓冲液等；反应条件需优化（退火温度、延伸时间），确保扩增出特异性目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳验证片段大小是否与预期一致。
4. 载体与目的基因的酶切与连接：选择合适的表达载体（如原核表达载体 pET-28a、真核表达载体 pcDNA3.1），用与引物相同的限制性内切酶对载体和 PCR 扩增的目的基因进行双酶切，回收酶切后的载体片段与目的基因片段；使用 T4 DNA 连接酶将两者连接，构建重组表达载体。
5. 重组载体的转化与筛选：将连接产物转化至感受态细胞（如 E.coli DH5α），涂布于含抗性标记（如氨苄青霉素、卡那霉素）的 LB 培养基平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，通过菌落 PCR 或质粒酶切验证重组载体是否构建成功，对阳性克隆进行测序验证，确保目的基因序列无突变。

（2）重组外膜蛋白的表达

1. 表达宿主选择与转化：根据表达需求选择宿主 —— 原核表达可选用 E.coli BL21（DE3）菌株，将重组原核表达载体转化至感受态细胞；真核表达可选用 HEK293T、CHO 等细胞，通过脂质体转染或电穿孔法将重组真核载体转入细胞。
2. 诱导表达：原核表达体系在菌液 OD600 达到 0.6-0.8 时，加入 IPTG（终浓度 0.1-1mmol/L），37℃诱导 3-6 小时（或低温诱导过夜）；真核表达体系转染后培养 48-72 小时，让蛋白充分表达。
3. 蛋白提取：原核表达产物可通过超声破碎细菌，离心收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵体，需后续复性）；真核细胞表达产物可收集细胞培养液（分泌型蛋白）或裂解细胞收集胞内蛋白。

（3）表达产物的鉴定

1. 分子量鉴定（SDS-PAGE 电泳）：将提取的蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，通过考马斯亮蓝染色，观察是否出现与预期外膜蛋白分子量一致的特异性条带，初步判断蛋白是否表达。
2. 特异性鉴定（Western blot）：将 SDS-PAGE 电泳后的蛋白转移至 PVDF 膜，封闭后加入一抗（针对该外膜蛋白的特异性抗体，或基于表达载体标签的抗体如 His-tag 抗体），孵育后加入荧光二抗，通过化学发光显影，若出现特异性条带，可确认目的蛋白成功表达。
3. 功能鉴定：若需验证蛋白的生物学活性，可进行体外结合实验 —— 将重组外膜蛋白与宿主细胞（或其表面受体）共孵育，通过流式细胞术或免疫荧光检测蛋白与细胞的结合能力，验证其是否具有天然外膜蛋白的受体结合功能。
4. 纯度鉴定：若需获得高纯度蛋白，可通过亲和层析（如 His-tag 蛋白用镍柱）、凝胶过滤层析等方法纯化，再通过 SDS-PAGE 电泳验证纯度，确保无明显杂蛋白条带。