2026 年军事医学科学院考博真题 样题

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2000 年军事医学科学院博士研究生入学考试《分子生物学》真题

一、名词解释（共 4 题，每题 5 分，共 20 分）

1. 基因 knock out 与 knock in
2. 酵母双杂交

答案解析

1. 基因 knock out（基因敲除）与 knock in（基因敲入）
   • 核心定义与技术原理：
     • 基因 knock out（基因敲除）：指通过基因工程技术（如同源重组、CRISPR-Cas9）将生物体基因组中特定基因的编码区或关键功能区破坏（如插入终止子、删除外显子），使该基因失去正常功能，从而在个体水平研究基因功能的技术。其核心逻辑是 “失活基因→观察表型变化→反向推导基因功能”，最早通过小鼠胚胎干细胞的同源重组实现（1989 年诺贝尔生理学或医学奖成果）。
     • 基因 knock in（基因敲入）：指在生物体基因组的特定位点插入外源基因（如报告基因、突变基因）或修饰内源基因（如点突变、荧光蛋白标签融合），且插入 / 修饰位点可控的技术。其核心逻辑是 “精准插入 / 修饰基因→实现基因功能的正向调控或可视化研究”，例如将绿色荧光蛋白（GFP）基因敲入内源基因启动子下游，通过荧光信号观察基因的时空表达模式。
   • 技术流程对比：

     技术环节	基因 knock out	基因 knock in
     载体构建	构建含 “同源臂 + 筛选标记基因（如 neo 基因）+ 终止子” 的载体，终止子插入目标基因编码区	构建含 “同源臂 + 外源基因 / 修饰序列 + 筛选标记基因” 的载体，外源基因插入目标位点（如基因启动子后）
     基因编辑效率	效率较高（仅需破坏基因功能，对插入片段要求低）	效率较低（需精准插入，对同源臂长度、片段完整性要求高）
     筛选策略	正负筛选（正筛选标记 neo 筛选重组细胞，负筛选标记 HSV-tk 排除随机整合）	依赖外源基因功能筛选（如荧光信号、药物抗性）或测序验证插入准确性
     典型应用	构建基因敲除小鼠，研究基因在发育、疾病中的作用（如 p53 基因敲除小鼠用于癌症研究）	构建基因敲入细胞系，研究基因定位（如 GFP 融合蛋白观察亚细胞定位）或疾病模型（如突变基因敲入模拟人类遗传病）

   • 学术延伸与临床意义：
     • 基因敲除技术的局限性：早期同源重组效率低（仅 10⁻⁶~10⁻⁵），且易产生 “脱靶效应” 或 “代偿机制”（其他基因代偿失活基因功能，导致表型不明显）；CRISPR-Cas9 技术的出现使效率提升至 50% 以上，且可实现多基因同时敲除，但仍需关注脱靶风险。
     • 基因敲入的临床潜力：在基因治疗中，可通过敲入正常基因修复致病突变（如镰状细胞贫血的 β- 珠蛋白基因敲入治疗）；在药物研发中，构建荧光标记的基因敲入模型，可实时监测药物对目标基因的调控效果，提升筛选效率。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）
   • 核心原理与技术设计：

     基于 “真核转录因子的 DNA 结合结构域（BD）与激活结构域（AD）分离后仍可通过蛋白质相互作用重构功能” 的特性，将目标蛋白（“诱饵蛋白”）与 BD 融合，候选蛋白（“猎物蛋白”）与 AD 融合，共转入酵母细胞：
     • 若诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用，则 BD 与 AD 重构为功能性转录因子，激活下游报告基因（如 lacZ、HIS3）的表达；
     • 通过检测报告基因的表达（如 X-gal 显色、营养缺陷型培养基生长），即可判断两种蛋白是否存在相互作用，甚至筛选未知的互作蛋白。
   • 技术流程与关键组件：
     1. 载体构建：
        • 诱饵载体：含 BD 基因（如 GAL4-BD）、多克隆位点（插入诱饵蛋白基因）、筛选标记（如 TRP1，用于酵母营养筛选）；
        • 猎物载体：含 AD 基因（如 GAL4-AD）、cDNA 文库（插入候选猎物蛋白基因）、筛选标记（如 LEU2）；
     2. 酵母转化与筛选：
        • 将两种载体共转入营养缺陷型酵母菌株（如 AH109，缺乏 TRP1、LEU2、HIS3 基因）；
        • 先在 SD/-Trp/-Leu 培养基筛选 “双转化子”（仅转入两种载体的酵母可生长）；
        • 再在 SD/-Trp/-Leu/-His/X-gal 培养基筛选 “阳性互作克隆”（仅蛋白相互作用的酵母可生长且显蓝色）；
     3. 验证与鉴定：
        • 挑取阳性克隆，提取猎物载体，通过测序确定猎物蛋白基因；
        • 采用 “反向双杂交”（互换 BD/AD 融合蛋白）或体外 pull-down 实验验证互作的特异性。
   • 技术优势、局限性与学术延伸：
     • 优势：
       • 体内检测：在酵母细胞内模拟真核蛋白的天然互作环境，比体外实验（如 pull-down）更接近生理状态；
       • 高通量筛选：可通过 cDNA 文库筛选与诱饵蛋白互作的未知蛋白，适用于蛋白质相互作用网络构建。
     • 局限性：
       • 假阳性高：部分蛋白可通过非特异性结合激活报告基因（如 AD 自身激活、BD - 诱饵蛋白自激活），需设置阴性对照（如单独转入诱饵载体检测自激活）；
       • 互作条件限制：仅适用于可进入酵母细胞核的蛋白（BD/AD 重构需在核内），膜蛋白、分泌蛋白需通过 “分裂泛素化双杂交” 等改良技术检测。
     • 学术延伸：
       • 衍生技术：酵母单杂交（研究蛋白与 DNA 的相互作用）、酵母三杂交（研究 RNA - 蛋白或小分子 - 蛋白相互作用）；
       • 应用场景：在病毒学中筛选病毒蛋白（如 HIV-1 Tat）与宿主细胞的互作蛋白，揭示病毒致病机制；在肿瘤研究中构建致癌蛋白（如 p53）的互作网络，发现潜在治疗靶点。

二、问答题（共 3 题，每题 10 分，共 30 分）

1. 真核基因在原核表达的难题及对策
2. 什么是蛋白质组？与基因组的区别？及其内容 / 策略？

答案解析

1. 真核基因在原核表达的难题及对策

   真核基因（如人类抗体基因、细胞因子基因）在原核系统（如大肠杆菌）中表达时，因 “真核与原核的基因表达调控机制差异” 常面临多种难题，需针对性设计对策，具体如下：

   难题类别	核心机制	解决方案
   1. 转录起始效率低	真核启动子（如 CMV、EF-1α）无法被原核 RNA 聚合酶识别，导致转录无法启动	替换为原核强启动子：如 T7 启动子（需 BL21 (DE3) 菌株表达 T7 RNA 聚合酶）、lac 启动子（可通过 IPTG 诱导）
   2. mRNA 稳定性差	真核 mRNA 的 poly (A) 尾、5' 端帽子结构在原核中缺失，易被原核核酸酶降解	构建 “茎环结构”：在 mRNA 5' 端插入原核核糖体结合位点（SD 序列）下游，3' 端插入 rho 因子不依赖的终止子，增强 mRNA 稳定性
   3. 翻译起始效率低	真核 mRNA 无原核 SD 序列（与 16S rRNA 互补），核糖体无法有效结合	载体设计时在真核基因 ATG 上游添加 SD 序列（如 “GGAGG”，距 ATG 6~8 bp），匹配原核核糖体结合需求
   4. 蛋白翻译后修饰缺失	原核细胞缺乏真核蛋白的修饰系统（如糖基化、磷酸化、二硫键形成），导致蛋白无活性	选择特殊原核菌株或系统： - 二硫键：使用 Origami 菌株（含 trxB、gor 基因突变，促进胞质二硫键形成）； - 糖基化：改用原核 - 真核穿梭载体（如毕赤酵母表达系统）
   5. 蛋白包涵体形成	真核蛋白在原核中表达过快，易折叠错误形成不溶性包涵体，无法纯化活性蛋白	优化表达条件： - 低温诱导：30℃以下诱导（如 20℃），减缓表达速度； - 低 IPTG 浓度：0.1~0.5 mmol/L IPTG，降低表达量； - 融合标签：与 GST、MBP 等可溶性标签融合，促进蛋白正确折叠
   6. 密码子偏好性差异	真核基因中的稀有密码子（如人类的 AGG、AGA 编码精氨酸）在原核中对应 tRNA 含量低，导致翻译停滞	载体共表达稀有密码子 tRNA 基因：如在表达载体中插入 argU、ileY 基因（编码 AGG/AGA、AUA 对应的 tRNA），或使用 Rosetta 菌株（已整合稀有密码子 tRNA 基因）

   • 典型案例与学术延伸：
     人干扰素 α（IFN-α）的原核表达：早期直接表达 IFN-α 基因时，因包涵体形成导致活性蛋白产量极低；通过 “SD 序列优化 + 低温诱导（25℃）+GST 融合标签” 改造后，可溶性 IFN-α 产量提升 10 倍以上，且通过凝血酶酶切可去除标签，获得天然活性蛋白。这一案例为真核蛋白的原核高效表达提供了经典范式。
2. 什么是蛋白质组？与基因组的区别？及其内容 / 策略？
   • 蛋白质组（Proteome）的核心定义：

     由澳大利亚科学家 Wilkins 于 1994 年提出，指 “特定细胞、组织或生物体在特定生理状态下表达的全部蛋白质的集合”，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、亚细胞定位、蛋白质相互作用等动态信息，是基因组 “功能实现的最终载体”（基因组是 “遗传信息的静态蓝图”）。
   • 蛋白质组与基因组的核心区别：

     对比维度	基因组（Genome）	蛋白质组（Proteome）
     信息性质	静态信息：同一生物的所有细胞共享相同基因组，且终身稳定	动态信息：不同细胞、不同生理状态（如细胞周期、疾病）的蛋白质组存在显著差异（如肝细胞与神经细胞的蛋白质组差异达 50% 以上）
     信息复杂度	线性信息：仅包含基因的核苷酸序列，信息量可通过基因组大小衡量（如人类基因组约 30 亿碱基）	非线性信息：包含蛋白质的 “序列 - 结构 - 功能” 多层级信息，且受翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）、蛋白互作影响，复杂度远高于基因组
     功能关联性	间接关联：基因序列需通过转录、翻译等过程转化为蛋白质才能实现功能，存在 “基因沉默”“转录后调控” 等脱节现象	直接关联：蛋白质是生命活动的直接执行者（如酶催化、信号传导、结构支撑），蛋白质组的变化直接反映细胞功能状态
     研究技术	以核酸为研究对象：基因组测序（NGS）、PCR、基因芯片	以蛋白质为研究对象：质谱（MS）、双向凝胶电泳（2-DE）、蛋白质芯片、免疫印迹（Western Blot）

   • 蛋白质组学的研究内容与核心策略：
     1. 研究内容：
        • 表达蛋白质组学：分析不同状态下蛋白质的表达差异（如肿瘤组织 vs 正常组织），筛选疾病标志物（如乳腺癌的 HER2 蛋白）；
        • 修饰蛋白质组学：鉴定蛋白质的翻译后修饰位点与类型（如磷酸化位点、乙酰化位点），揭示修饰对蛋白功能的调控（如 p53 的 Ser15 磷酸化激活其抑癌功能）；
        • 互作蛋白质组学：构建蛋白质相互作用网络（如酵母双杂交、co-IP 结合质谱），解析信号通路（如 MAPK 信号通路的蛋白互作 cascade）；
        • 亚细胞蛋白质组学：分离特定亚细胞结构（如线粒体、内质网），分析其专属蛋白质组，研究细胞器功能（如线粒体蛋白质组与氧化磷酸化障碍的关联）。
     2. 核心研究策略：
        • 自上而下（Top-down）策略：直接对完整蛋白质进行质谱分析，保留翻译后修饰的完整信息，适用于修饰位点鉴定；
        • 自下而上（Bottom-up）策略：将蛋白质酶解为肽段后进行质谱分析，结合数据库搜索（如 UniProt）鉴定蛋白质，适用于高通量表达差异分析；
        • 靶向蛋白质组学（MRM/PRM）：针对目标蛋白的特定肽段设计质谱检测方法，实现蛋白质的定量分析（如临床样本中肿瘤标志物的精准定量）。
   • 学术延伸与临床应用：

     蛋白质组学在精准医学中具有核心价值，例如：在肿瘤诊断中，通过比较癌组织与正常组织的蛋白质组，发现了 “循环肿瘤蛋白标志物”（如肺癌的 CYFRA21-1）；在药物研发中，通过分析药物作用后的蛋白质组变化，鉴定药物靶点（如阿司匹林通过抑制 COX-1 蛋白发挥抗炎作用），推动 “靶点导向药物设计” 的发展。

真题获取与备考建议

1. 考博信息网官网：http://www.kaoboinfo.com/
2. 军事医学科学院历年考博真题下载专用页面：http://www.kaoboinfo.com/shijuan/school/408061_1_473441.html

备考建议

1. 夯实理论基础：以《分子克隆实验指南》《基因 VIII》为核心教材，重点掌握 “基因表达调控”“蛋白质相互作用”“基因编辑技术” 等核心章节，建立 “DNA→RNA→蛋白质→功能” 的分子生物学逻辑链；
2. 强化技术原理理解：针对真题中高频出现的技术（如酵母双杂交、基因敲除、蛋白质组学质谱技术），不仅要记忆流程，更要理解 “技术设计的科学依据”（如酵母双杂交的转录因子拆分原理），避免死记硬背；
3. 关注技术前沿与临床转化：阅读《Molecular Cell》《Cell Reports》等核心期刊，了解 CRISPR-Cas9 的最新改良（如碱基编辑、引导编辑）、单细胞蛋白质组学等前沿技术，将其与传统知识点结合，提升答题的学术深度；
4. 真题实战训练：通过历年真题练习，总结名词解释的 “定义 + 原理 + 应用” 框架、问答题的 “问题 - 机制 - 对策 - 案例” 框架，提升学术表述的条理性与精准性。